Individuazione rapida della SARS

Nov 14, 2023

Nature Biomedical Engineering volume 6, pagine 944–956 (2022) Citare questo articolo

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I test rapidi degli acidi nucleici sono fondamentali per la sorveglianza delle malattie infettive. Qui riportiamo un test per il test rapido del COVID-19 e la sua implementazione in un prototipo di dispositivo microfluidico. Il test, che abbiamo chiamato DISCoVER (per la diagnostica con reporting enzimatico del coronavirus), prevede la lisi del campione senza estrazione tramite reagenti stabili e a basso costo, amplificazione isotermica multiplex dell'RNA seguita dalla trascrizione T7 e scissione mediata da Cas13 di un fluoroforo spento . Il dispositivo è costituito da una cartuccia microfluidica monouso a gravità inserita in uno strumento compatto per l'esecuzione automatizzata del test e la lettura della fluorescenza entro 60 minuti. DISCoVER è in grado di rilevare la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2) nella saliva con una sensibilità di 40 copie μl-1 ed è risultato sensibile al 94% e specifico al 100% quando convalidato (contro PCR quantitativa) utilizzando l'RNA totale estratto da 63 campioni di tampone nasale (33 SARS-CoV-2 positivi, con valori di soglia del ciclo pari a 13-35). Il dispositivo ha identificato correttamente tutti i campioni di saliva clinica testati (10 positivi per SARS-CoV-2 su 13, con valori di soglia del ciclo di 23-31). I test rapidi degli acidi nucleici presso il punto di cura possono ampliare l’uso della diagnostica molecolare.

Il rilevamento rapido degli acidi nucleici presso il punto di cura è un componente fondamentale di una solida infrastruttura di test per il controllo della trasmissione delle malattie. Epidemie come la pandemia del coronavirus 2019 (COVID-19) hanno evidenziato i limiti del modello di laboratorio diagnostico centralizzato e i suoi lunghi tempi dal campione alla risposta. I test sviluppati in laboratorio, come la reazione quantitativa a catena della polimerasi (qPCR), vengono condotti in strutture che richiedono personale ad alta intensità di lavoro e infrastrutture per attrezzature per l'adesione dei campioni, l'estrazione degli acidi nucleici, il termociclaggio e l'analisi dei dati. Anche i tempi di trasporto dei campioni e di refertazione dei risultati contribuiscono notevolmente ai tempi di consegna dei test centralizzati. Lo sviluppo di un dispositivo microfluidico di facile utilizzo abbinato al rilevamento in loco consentirebbe di aumentare il volume e l'accesso ai test molecolari rapidi.

Finora, ben oltre 6 milioni di decessi dovuti a COVID-19 sono dovuti a oltre 500 milioni di infezioni causate dal suo agente eziologico, la sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2). La miriade di sfide rappresentate da un elevato tasso di infezione asintomatica1, da test insufficienti e da una finestra temporale ristretta affinché i test molecolari siano altamente sensibili2,3 possono essere combattute mediante un’ampia diffusione della diagnostica molecolare in loco, ad esempio all’ingresso sul posto di lavoro o in classe. Esiste anche un enorme potenziale per i test di sorveglianza comunitaria per aumentare i flussi di lavoro clinici, dove i casi positivi vengono confermati mediante il rinvio a una fornitura più limitata di test di livello clinico. Metodi di campionamento e tecnologie di test alternativi possono anche aiutare a diversificare la catena di fornitura diagnostica, poiché la pipeline standard per i test clinici può essere limitata dalla carenza di kit di estrazione dell’RNA o di tamponi4,5.

Abbiamo quindi cercato di sviluppare un metodo che non richiedesse l'estrazione dell'RNA o tamponi del tratto respiratorio superiore e che potesse essere integrato in un flusso di lavoro microfluidico rapido e automatizzato. I test basati su qPCR sono stati precedentemente sviluppati con l'aggiunta diretta del campione e in genere utilizzano una temperatura elevata per la lisi del campione6. Altri approcci hanno sfruttato agenti caotropici, riduzione chimica e inibitori della RNasi6,7,8,9. Inoltre, è stato riportato che i campioni di saliva presentano una concordanza del 97% con i tamponi nasofaringei (NP)10,11.

Il rilevamento basato su brevi ripetizioni palindromiche raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR) è un nuovo approccio promettente per la diagnostica degli acidi nucleici. Questi metodi si basano sull'attivazione dipendente dall'RNA guida delle nucleasi Cas13 o Cas12 per indurre rispettivamente l'attività nucleasica di RNA a filamento singolo o DNA a filamento singolo non specifica, al fine di scindere e rilasciare una molecola reporter ingabbiata12,13,14, 15,16,17,18,19. Il reporter rilasciato può essere misurato quantitativamente con un rilevatore a fluorescenza per leggere il risultato del test. Il rilevamento basato su CRISPR è altamente specifico, ma le sole nucleasi Cas13 possono impiegare fino a 2 ore per raggiungere la sensibilità attomolare per applicazioni diagnostiche20,21. Al contrario, l'amplificazione isotermica mediata da loop (LAMP) esegue un'amplificazione altamente sensibile dell'acido nucleico in meno di 20 minuti con limiti di rilevamento attomolari20 (LOD). Tuttavia, nonostante la sensibilità e la velocità della LAMP, tali metodi isotermici sono spesso soggetti ad amplificazione non specifica22,23.