Un linfatico

Jun 21, 2023

Nature Communications volume 13, numero articolo: 4730 (2022) Citare questo articolo

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L’attivazione dei nodi di segnalazione compensatoria nel cancro spesso richiede terapie combinate che sono spesso afflitte da tossicità dose-limitanti. L’assorbimento dei farmaci a livello linfatico intestinale è raramente esplorato, anche se si prevede che una ridotta tossicità e livelli sostenuti di farmaco miglioreranno la biodisponibilità sistemica. Un potente inibitore multifunzionale della chinasi biodisponibile per via orale (LP-182) è descritto con partizionamento linfatico intrinseco per il targeting combinato delle vie di segnalazione della fosfoinositide 3-chinasi (PI3K) e della proteina chinasi attivata dal mitogeno (MAPK) senza tossicità osservabile. Dimostriamo selettività ed efficacia terapeutica attraverso la riduzione dell'attivazione della chinasi a valle, il miglioramento dei fenotipi della malattia e il miglioramento della sopravvivenza in modelli animali di mielofibrosi. La nostra ulteriore caratterizzazione delle proprietà sintetiche e fisico-chimiche per l’assorbimento linfatico di piccole molecole supporterà i continui progressi nella terapia linfotropica per alterare le traiettorie della malattia di una miriade di indicazioni di malattie umane.

Le vie di segnalazione aberranti nel cancro possono eludere la terapia attraverso la resistenza intrinseca o meccanismi compensatori che guidano uno stato resistente. L'attivazione della segnalazione oncogenica PI3K e MAPK ha ispirato lo sviluppo di farmaci a bersaglio molecolare, facilitando strategie di trattamento combinato progettate per superare tali adattamenti dovuti alla diafonia di segnalazione e all'attivazione di effettori a valle1,2,3. Tuttavia, i trattamenti che utilizzano combinazioni di inibitori della chinasi rimangono una sfida clinica poiché gli studi hanno faticato a creare un equilibrio positivo tra guadagni in sopravvivenza, efficacia terapeutica e tossicità dose-limitante4,5. Gli inibitori multifunzionali della chinasi a singolo agente potrebbero fornire rapporti di dosaggio coerenti e sinergici contro più bersagli contemporaneamente, bloccando così le vie di segnalazione oncogenica compensatorie e riducendo al minimo la prospettiva di effetti avversi6,7.

Evitare il metabolismo di primo passaggio epatico mediante sequestro e trasporto attraverso i vasi linfatici gastrointestinali può potenzialmente migliorare l'esposizione al farmaco riducendo al tempo stesso le tossicità dose-limitanti spesso osservate nelle terapie di combinazione8. Nonostante i potenziali vantaggi, questa via di somministrazione dei farmaci è rimasta poco esplorata dall’industria farmaceutica, probabilmente a causa della limitata comprensione delle proprietà chimiche e farmacocinetiche necessarie per l’assorbimento linfatico piuttosto che venoso portale di piccole molecole. Esempi precedenti di piccole molecole che hanno dimostrato di raggiungere l'assorbimento linfatico includono vitamine D3 ed E, alofantrina e cannabinoidi sintetici9,10,11,12,13,14. Sebbene i coniugati anfifilici o macromolecolari e le formulazioni a rilascio controllato siano stati valutati per l'assorbimento linfatico dei carichi terapeutici, questa strategia fa sì che la maggior parte della composizione molecolare complessiva sia terapeuticamente inerte15,16,17,18,19,20,21,22. Superare le barriere chimiche, fisiche e biologiche dell’assorbimento linfatico di piccole molecole ridurrà la scarsità dei futuri sforzi di scoperta di farmaci diretti al sistema linfatico.

Utilizzando la chimica medicinale sintetica insieme a studi di docking computazionale, riportiamo lo sviluppo di un inibitore della chinasi multifunzionale a molecola singola potente e selettivo, biodisponibile per via orale (LP-182) contro le vie di segnalazione PI3K e MAPK. Le qualità fisico-chimiche uniche dell'LP-182 si discostano dagli studi precedenti in quanto la struttura chimica in massa è terapeuticamente attiva, ottenendo l'assorbimento linfatico dopo la somministrazione orale. Il sequestro di LP-182 nel sistema linfatico mesenterico determina livelli estesi di farmaco e metabolita attivo nella circolazione sanguigna sistemica, migliorando la biodisponibilità complessiva e diminuendo la tossicità osservabile. L'efficacia preclinica di LP-182 nell'oncogene della leucemia mieloproliferativa (MPLW515L) modello murino di mielofibrosi (MF)23, una neoplasia ematologica con marcato coinvolgimento di organi linfoidi secondari come la milza24, è stata dimostrata dal miglioramento dei fenotipi della splenomegalia e della malattia fibrotica e una sopravvivenza globale estesa. La mielofibrosi deriva prevalentemente da mutazioni nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) che attivano la Janus chinasi 2 (JAK2) e la resistenza agli inibitori JAK2 standard di cura (Ruxolitinib, Fedratinib) è stata dimostrata come conseguenza della concomitante attivazione di PI3K compensatorio. e segnalazione di sopravvivenza MAPK25,26,27. Il trattamento orale di topi MPLW515L con LP-182 ha comportato anche una rinormalizzazione delle popolazioni di cellule del sangue e un'attenuazione dell'attività di segnalazione della proteina chinasi B a valle (PKB/AKT) e della proteina chinasi 1/2 regolata dal segnale extracellulare (ERK1/2) nel midollo osseo e splenociti isolati. Un'ulteriore dimostrazione di uno schema sintetico per la generazione di classi di inibitori linfatici multi-bersaglio della chinasi e la caratterizzazione delle caratteristiche fisico-chimiche centrali per l'assorbimento linfatico, fornisce un percorso per far avanzare l'applicazione di terapie linfotropiche di piccole molecole nel trattamento delle malattie umane.

5-fold increase in inhibition of cellular proliferation (IC50 0.73 ± 0.071 µM) as compared to treatment with LP-182, or >2-fold increase as compared to each individual metabolite in isolation (Fig. 2d). Thus, the balance among potencies, plasma concentrations, and prolonged systemic oral bioavailability of LP-182 and its metabolites may contribute to reduced toxicity and an overall net therapeutic benefit in vivo./p> LP-182 > LP-616), however the lymph node to blood ratio was most pronounced for LP-182 suggesting that chemical tuning of cLogP may provide opportunities to control directly lymphatic absorption and/or partitioning (Fig. 6f). In contrast, LP-65 active metabolite and short-lived precursor levels (AZD8055 & LP-622) were elevated in both blood and lymph node as compared to LP-616 and LP-182 metabolic equivalents (AZD2014CA & LP6-26 and LP-527 & LP-622, respectively) (Supplementary Fig. 12c). Together, these data suggest that both LP-65 and LP-616 undergo lymphatic uptake, and that release into systemic circulation from lymphatic reservoirs influences overall oral bioavailability and first-pass drug metabolism of lymphatropic kinase inhibitors (Supplementary Fig. 12a–c). As metabolic decomposition of LP5-37 generates two equivalents of the PD315209 metabolite due to its chemical symmetry, the reciprocal levels of both LP5-37 and PD315209 observed among lymph node and blood (Supplementary Fig. 12d) further supports the lymphatic system as a controlled form of lymphatropic drug release into the systemic circulation. We propose this mode of absorptive drug release would reduce dose-limiting toxicities, providing for a diverse range of single-agent, combination and multi-targeted lymphatropic therapies capable of sustaining efficacious dosing ratios, to overcome compensatory signaling and resistance mechanisms in human diseases including cancer and autoimmune disorders./p>50 ng mL−1, levels that were maintained for PD0316684 over 24 h upon LP-182 oral administration49. Likewise, sustained 20 ng mL−1 plasma levels of LP-527 were also observed following LP-182 oral dosing, concentrations which have been shown to down modulate PI3K signaling by the archetype GSK2126458 in breast cancer xenograft models28. By avoiding potential off-target effects and toxicity profiles associated with initial maximum serum concentrations (Cmax), these consistent and stable plasma concentrations within the therapeutic window are anticipated to extend the overall efficacy and therapeutic benefits of this class of lymphatically-directed inhibitors. Similar physiochemical and pharmacokinetic characteristics of additional multi-functional kinase inhibitors LP5-37, LP-616, and LP-65 to those of LP-182 signifies a generalized route for synthesis of lymphatropic small molecule kinase inhibitors with considerable therapeutic potential./p>96% chemical purity by reversed-phase gradient HPLC analysis./p>

600 mg kg−1 so suspensions were administered for these concentrations. Urine and fecal samples were collected over 24 h at 24, 48 and 72 h intervals using metabolic cages, and quantitation of LP-182 in each sample was determined by the University of Michigan Pharmacokinetics Core. Briefly, water was added to fecal samples at an average ratio of 2.5 ± 1.6 (w/w) water:feces to generate fecal homogenates using a tissue homogenizer (Omni International TH), then approximately 200 mg of homogenate was diluted 5-fold with 20% (v/v) acetonitrile in water prior to analysis. All sample processing, chromatographic separation, MS, and MS/MS parameters used for analysis were determined by the core as outlined in the Methods section of the manuscript. Standard curves were generated from purified compounds and internal standard (CE302) spiked in equivalent biological matrices to determine sample analyte concentrations as above, with all curves displaying a correlation coefficient r2 ≥ 0.992 and a linear dynamic range in between 0.01 µg mL−1 and 100 µg mL−1 depending on the specific matrix, dosing, and time point analyzed (24, 48, or 72 h). The cumulative amount of compound recovered over 72 h in feces and urine was determined from sample analyte concentrations provided by the core, then converted to percent recovered by normalization to the amount of compound administered. Percent oral bioavailability was determined as the percent difference between the amount of compound administered to the amount of compound recovered over 72 h in feces. LP-182 dose (mg kg−1):LP-182 administered (mg) is 100:2.7; 200:5.4; 400:10.8; 600:16.2; 800:21.6; 1000:27.0. Data was generated from n = 4 individual animals per compound dose./p>600 mg kg−1) in Maisine CC was incomplete, so suspensions were administered for these compound dosages. Whole blood and mesenteric lymph nodes were collected either 30 min or 4 h following compound administration and stored at −20 °C until future processing and analysis by the University of Michigan Pharmacokinetics Core as above, or as outlined below, to determine compound concentrations in each tissue. For analyses performed by the core, sample processing, chromatographic separation, MS, and MS/MS parameters used were determined therein, and calculated sample analyte concentrations provided. Here, standard curves were generated from purified compounds and internal standard (CE302) spiked in equivalent biological matrices to determine sample analyte concentrations as above, with all curves displaying a correlation coefficient r2 ≥ 0.997 and a linear dynamic range in between 10 ng mL−1 and 20 µg mL−1 depending on the specific matrix, dosing, and compound analyzed. Data was generated from n ≥ 4 individual animals per compound per study group or dose. A single data set presented in Fig. 3b is also represented as a ratio in Fig. 6b (PD0316684, 100 mg kg−1, 4 h). One animal was excluded from blood and mesenteric lymph node analysis (LP-182, 400 mg kg−1, 4 h; Fig. 6e and associated figures) as an identified outlier based on testing by ROUT method (Q = 0.1%)./p>

3.0.CO;2-V" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F1520-6017%28200008%2989%3A8%3C1073%3A%3AAID-JPS12%3E3.0.CO%3B2-V" aria-label="Article reference 11" data-doi="10.1002/1520-6017(200008)89:83.0.CO;2-V"Article CAS PubMed Google Scholar /p>

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