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Oct 18, 2023

Nature Communications volume 14, numero articolo: 294 (2023) Citare questo articolo

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La coniugazione è un meccanismo contatto-dipendente per il trasferimento del DNA plasmidico tra cellule batteriche, che contribuisce alla diffusione della resistenza agli antibiotici. Qui utilizziamo la microscopia a cellule vive per visualizzare la dinamica intracellulare del trasferimento coniugativo del plasmide F in E. coli, in tempo reale. Mostriamo che il trasferimento del plasmide in forma a singolo filamento (ssDNA) e la sua successiva conversione in DNA a doppio filamento (dsDNA) sono processi rapidi ed efficienti che si verificano con tempistiche e localizzazione subcellulari specifiche. In particolare, la conversione da ssDNA a dsDNA determina i tempi di produzione delle proteine ​​codificate dal plasmide. La regione principale che entra per prima nella cellula ricevente trasporta promotori a filamento singolo che consentono la sintesi precoce e transitoria delle proteine ​​principali immediatamente dopo l'ingresso del plasmide ssDNA. La successiva conversione in dsDNA disattiva l'espressione genica principale e attiva l'espressione di altri geni plasmidici sotto il controllo di promotori convenzionali a doppio filamento. Questa strategia molecolare consente la produzione tempestiva di fattori coinvolti sequenzialmente nella creazione, nel mantenimento e nella diffusione del plasmide.

La coniugazione del DNA batterico è un diffuso meccanismo di trasferimento genico orizzontale in cui l'informazione genetica viene trasmessa da una cellula donatrice a una cellula ricevente mediante contatto diretto1,2,3,4. La coniugazione è responsabile della diffusione intra e inter-specie di varie proprietà metaboliche e rappresenta l'80% delle resistenze acquisite nei batteri5. Il plasmide F è stato il primo elemento coniugativo scoperto1,6 ed è ora documentato come il rappresentante paradigmatico di un ampio gruppo di plasmidi coniugativi diffusi nell'Escherichia coli e in altre specie di Enterobacteriaceae, in cui sono associati alla diffusione di colicine, fattori di virulenza e antibiotici resistenza7,8,9. A causa della loro importanza clinica e fondamentale, i plasmidi di tipo F sono stati al centro di studi approfonditi che hanno fornito una comprensione dettagliata delle reazioni molecolari e dei fattori coinvolti nel loro trasferimento mediante coniugazione3,4.

All'interno della cellula donatrice, i componenti del relaxosoma, compreso il fattore ospite di integrazione IHF, le proteine ​​accessorie codificate dal plasmide TraY, TraM e la rilassasi multifunzionale TraI, vengono reclutati nell'origine di trasferimento (oriT) del plasmide F10,11,12. Il complesso relaxosoma viene quindi reclutato nel sistema di secrezione di Tipo IV (T4SS) dalla proteina di accoppiamento TraD, determinando la formazione del complesso di pre-inizio13,14,15,16,17. Le proteine ​​TraI e TraD sono componenti archetipici dell'insieme centrale di subunità necessarie per la creazione di un meccanismo di coniugazione attivo e sono indicate rispettivamente come VirD2 e VirD4 nella nomenclatura comune. Si propone che la costituzione della coppia di accoppiamento induca un segnale ancora non caratterizzato che attiva il complesso di pre-inizio. Quindi, TraI introduce un taglio (nick) di DNA sito e filamento specifico nell'oriT del plasmide e rimane legato covalentemente all'estremità 5' del fosfato. TraI funge anche da elicasi che estrude il plasmide ssDNA da trasferire, chiamato T-strand18,19,20,21,22,23,24,25,26. Inizialmente è stato suggerito e successivamente confermato che per svolgere queste funzioni sono necessarie due rilassasi27,28. In questa fase, il 3'OH del filamento T serve ad avviare la replicazione del cerchio rotante (RCR) che converte il plasmide circolare ssDNA intatto in dsDNA nella cellula donatrice3,29,30, mentre il 5'fosfato si lega a TraI viene trasferito nella cellula ricevente attraverso il macchinario T4SS. Sebbene la struttura molecolare del T4SS sia stata ben caratterizzata31,32,33,34, il modo in cui il complesso T (nucleoproteina T-strand-TraI) viene traslocato attraverso la membrana delle cellule donatrici e riceventi rimane poco chiaro.