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Oct 12, 2023

Biologia delle comunicazioni volume 6, numero articolo: 173 (2023) Citare questo articolo

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Gli organoidi del cervello umano bioingegnerizzati e completamente maturati rappresentano modelli tridimensionali di mimetica cerebrale in vitro di grande valore per ricapitolare lo sviluppo del cervello in vivo, le malattie dello sviluppo neurologico e neurodegenerative. Vari segnali istruttivi che influenzano molteplici processi biologici tra cui la morfogenesi, gli stadi di sviluppo, le transizioni del destino cellulare, la migrazione cellulare, la funzione delle cellule staminali e le risposte immunitarie sono stati impiegati per la generazione di organoidi cerebrali fisiologicamente funzionali. Tuttavia, gli attuali approcci alla maturazione richiedono un miglioramento degli organoidi cerebrali altamente raccoglibili e funzionali con variabilità ridotte da lotto a lotto. Qui, dimostriamo due diversi approcci ingegneristici, il bioreattore a microgravità del sistema di coltura cellulare rotante (RCCS) e una piattaforma microfluidica di nuova concezione (piattaforma µ) per migliorare la raccolta, la riproducibilità e la sopravvivenza degli organoidi cerebrali di alta qualità e confrontarli con quelli dei tradizionali sistemi di rotazione e scuotimento. Gli organoidi RCCS e della piattaforma µ hanno raggiunto dimensioni ideali, circa il 95% di raccoglibilità, tempo di coltura prolungato con cellule proliferative, adesive e di tipo endoteliale Ki-67 + /CD31 + /β-catenina+ e hanno mostrato una diversità cellulare arricchita (abbondante neurale/gliale/ popolazione di cellule endoteliali), morfogenesi strutturale del cervello, ulteriori identità neuronali funzionali (neuroni glutammatergici, GABAergici e ippocampali che secernono glutammato) e sinaptogenesi (interazione presinaptica-postsinaptica) durante lo sviluppo dell'intero cervello umano. Entrambi gli organoidi hanno espresso CD11b + /IBA1 + microglia e oligodendrociti MBP + /OLIG2 + ad alti livelli al giorno 60. Gli organoidi RCCS e della piattaforma µ mostrano alti livelli di fedeltà fisiologica un alto livello di fedeltà fisiologica può servire come modelli preclinici funzionali da testare nuovi regimi terapeutici per le malattie neurologiche e trarre vantaggio dal multiplexing.

La comprensione della generazione, della maturazione e dello sviluppo funzionale del cervello è vitale per comprendere lo sviluppo evolutivo del cervello, nonché per sviluppare strategie di trattamento per le malattie neurodegenerative e dello sviluppo neurologico1,2. Sebbene i modelli animali siano utili per l'esame meccanico, la ricapitolazione dello sviluppo del cervello umano è significativamente limitata a causa delle differenze a livello cellulare e molecolare3. Inoltre, gran parte della nostra attuale conoscenza del cervello umano si basa sull’analisi di campioni post-mortem o patologici inappropriati per la manipolazione sperimentale4. Ultimamente, le cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), avendo la capacità di rigenerarsi continuamente con fattori di riprogrammazione (OCT4, SOX2, c-MYC e KLF4) e di differenziarsi in tutti i tipi di cellule del corpo, hanno aperto una nuova strada per lo studio dei neuroni umani. sviluppo5. Con il primo protocollo di generazione di organoidi cerebrali 3D derivato da iPSC pubblicato da Lancaster et al.6, gli organoidi cerebrali sono diventati rivoluzionari con la capacità di auto-organizzarsi, formare strutture più complesse, trasformarsi in diverse regioni progenitrici, imitare la composizione del tipo cellulare/tessuto organizzazione del cervello embrionale e assomigliano alla struttura spaziale del cervello7. Inoltre, analogamente al processo di formazione e sviluppo del cervello nel periodo embrionale, gli organoidi cerebrali possono imitare da vicino il cervello umano generando programmi epigenomici e trascrizionali come segnali associati alla diversità cellulare, chiarificazione delle sinapsi funzionali, formazione di spine dendritiche e creazione di reti neuronali autoattivate8,9.

Gli approcci convenzionali alla maturazione degli organoidi cerebrali che utilizzano spinner10 e shaker11 promuovono l'organizzazione auto-neuronale e la formazione di spazi ventricolari cerebrali fornendo agitazione. Tuttavia, questi metodi presentano importanti limitazioni, tra cui la diffusione alterata dei nutrienti e le zone apoptotiche dovute alla mancanza di vascolarizzazione, deficit di cellule immunitarie, dipendenza da matrigel, bassa riproducibilità, scalabilità e alta variabilità dei componenti e delle cellule cerebrali indotte12. Sono state sviluppate diverse strategie per prevenire queste limitazioni, ad esempio mediante la co-coltura con cellule endoteliali vascolari ombelicali umane (HUVEC)13 e cellule endoteliali umane derivate da iPSC non solo per migliorare la diffusione di ossigeno/nutrienti ma anche per sfruttare la differenziazione neurale, la migrazione e la formazione del circuito durante lo sviluppo14. Altre strategie si concentrano sulla ricapitolazione dell'ambiente microfisiologico cellulare con matrice extracellulare cerebrale decellularizzata (ECM)15 o matrice sintetica simile all'ECM per promuovere la differenziazione neurale e gliale durante l'organogenesi cerebrale16,17. Sebbene non completamente risolti, i problemi di bassa riproducibilità, scalabilità e alta variabilità degli organoidi cerebrali sono stati tentati di superare con diverse piattaforme organoidi su chip18,19 o nuovi sistemi di bioreattori come i bioreattori a ruota verticale monouso20. Nonostante il progresso delle tecnologie degli organoidi, le forze emodinamiche come lo stress di taglio, lo stiramento ciclico e la distribuzione dei fluidi che regolano i percorsi meccanosensibili negli organoidi cerebrali non sono ancora chiaramente comprese, il che rappresenta un'altra limitazione critica. Tuttavia, è noto che i segnali meccanosensibili associati al flusso del liquido cerebrospinale durante l'embriogenesi regolano importanti adattamenti strutturali come l'orientamento della forma embrionale con l'effetto dell'asimmetria sinistra-destra, la polarizzazione delle cellule gliali radiali, la differenziazione/funzionalizzazione delle cellule staminali neurali e successivi eventi di piegamento dei tessuti21,22. Pertanto, è necessario sviluppare piattaforme che utilizzino principi biologici e ingegneristici in grado di emulare le dinamiche spaziotemporali e le interazioni cellula-cellula/cellula-ambiente. Qui, analizziamo gli effetti di varie caratteristiche del flusso sia computazionalmente che sperimentalmente sulla maturazione degli organoidi cerebrali e individuiamo la migliore strategia per ingegnerizzare organoidi cerebrali 3D derivati da iPSC a livello molecolare, cellulare e funzionale. La piattaforma microfluidica (piattaforma µ) consente un flusso laminare guidato dalla gravità che imita il flusso del fluido esistente negli spazi cerebrospinali e interstiziali e migliora la diafonia cellula-cellula, l'apporto di ossigeno e lo scambio di nutrienti/rifiuti7,23, portando a organoidi di maggiore durata. Inoltre, le condizioni di microgravità e flusso laminare insolitamente fornite dai bioreattori del sistema di coltura cellulare a rotazione orizzontale (RCCS) mostrano forze idrodinamiche omogenee che facilitano il controllo preciso a lungo termine delle interazioni cellula-cellula e consentono un'elevata raccoglibilità e riproducibilità degli organoidi cerebrali maturati. L'RCCS, ispirato alle condizioni straordinarie delle tecnologie spaziali24, può essere uno strumento unico nella ricerca sugli organoidi grazie alla riduzione dello stress di taglio, all'aumento del trasferimento di massa e alla diminuzione del danno cellulare rispetto ai sistemi tradizionali25. Ipotizziamo che la microgravità e i flussi laminari guidati dalla gravità migliorino la maturazione degli organoidi cerebrali portando a reti spaziali gerarchicamente complesse che riassumono le caratteristiche dello sviluppo corticale embrionale umano.

0.5, mostly for RCCS p = 0.9945). In spite of the low-velocity fields exercised in the RSSC and the µ-platform, nutrient mixing has been efficient to support organoid growth and low shear environment yielded homogeneous size distributions, which is of prime importance for multiplex testing in the pharmaceutical industry./p>40-day organoids with GABA polarity switch were regarded as indicators of progressive neuronal network maturation78. On the other hand, the glutamate level that was secreted from microglia was measured at around 20 µM in healthy in vitro neuronal cultures79,80. Given that, the change in the uptake and consequently release rate of extracellular glutamate in 60-day RCCS and µ-platform organoids and growth in organoid sizes might be associated with more mature states. One of the distinguishing features of neuronal circuits and maturation is the switch from excitatory to inhibitory GABAergic neurotransmission. GABA-A, a presynaptic GABAergic interneuron receptor that modulates neurotransmitter release in both peripheral and central synapses7,78,81,82,83, was more expressed in both RCCS and µ-platform organoids with CTIP2+ deep-layer of cortical neurons as of day 60 (Fig. 5a–c, Supplementary Fig. 2c). Thus, the neuronal network complexity was validated in RCCS and µ-platform organoids with the presence of both presynaptic glutamatergic VGLUT1+ and GABAergic GABA-A+ neurons, which are critically involved in neuronal network oscillations, as well as postsynaptic PSD95+ neurons, GFAP+/S100B+ astrocytes, and MBP+/OLIG2+ oligodendrocytes./p> 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, n = 4 for independent replicates = 2). e The top five biological processes (Gene Ontology) and f tissue expression (tissues) enrichments of upregulated genes (Log2 transformation of fold regulation ≥1.9, p-value < 0.05, independent replicates = 2) of cerebral organoids matured in dynamic systems on day 120./p> 0.05, ****p < 0.0001) and e TUNEL apoptosis fluorescent staining images of sectioned organoids at days 60 and 120. DNAse-treated organoid section matured in the RCCS system is used as a control group. The DAPI-stained cell nucleus (blue), green fluorescent stained apoptotic zones in the cell nucleus (green), and white arrows indicate neural rosette-like structures (scale bars = 200 μm, independent replicates = 3, Zeiss Axio Vert.A1)./p> 0.05), the highest DNA breakage was observed in the shaker, where the organoids were exposed to the highest shear stress, whereas the lowest apoptotic signals were noted in µ-platform and RCCS organoids exposed to at least 100-fold less shear stress. Approaching day 120, the presence of apoptotic cells in the inner regions of the organoids cultured under static conditions dramatically increased to 89.6% ± 6.2 due to nutrient-oxygen deficiencies, as the organoid size increased91. Besides, the cellular damages in the peripheral regions of organoids matured in shaker and spinner cultures were observed to increase from day 60 to 120 (p < 0.0001, apoptotic zone of 73.8% ± 5.9 and 66.5% ± 6) due to uneven hemodynamic forces and higher shear stresses. On the other hand, the detection of few apoptotic cells in organoids cultured in µ-platform and RCCS yielded the highest survival rates with significantly lower apoptotic zones of 10.4% ± 4.2 and 16.5% ± 2.2, respectively. Consequently, organoids matured in dynamic systems showed more prominent cell viabilities by reduced cell deaths at the center of organoids with sufficient nutrient-gas supply and less cell apoptosis-induced organoid survival due to the effective agitation in different dynamic flow regimes compared to the static group6,92, mostly in the µ-platform12,93 and RCCS systems that provided complex cytoarchitecture in organoid maturation./p>95% harvestability. Although scale-up was not planned for this study, we presume that about 1000 matured organoids can be harvested in one batch, if we scale up to 500 ml RCCS STLVs, as such the µ-platform can be multiplied by connecting in a parallel or serial manner for scale-up purposes. This study suggests that RCCS and µ-platform organoids showing a high level of physiological fidelity can serve as functional preclinical models for testing new therapeutic regimens and benefit from multiplexing./p>350–400 µm./p> 0.05, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001 were used. The Student's t-test was also used for qRT-PCR analyses (independent replicates = 2 with RNA isolate pool containing at least two organoids from the same batch). On the other hand, H&E, IF and TUNEL staining were made with three independent replicates using three individual organoids at different times, while WB analysis were carried out with two independent replicates using protein lysate pool from at least two organoids from the same batch./p>

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